首次人体临床试验起始剂量是创新药物临床申请的关键信息，也是非临床安全性评价的重要推导数据，而药物的非临床安全性评价也是药物进入首次人体临床试验，药物临床开发过程中结合临床试验方案控制受试者安全性风险的重要过程。我们收集了近几年公开发表的重要文章，分期登出，供大家交流。本期文章《双特异性抗体药物非临床研究的考虑要点》主要针对双特异性抗体药理毒理专业审评中关注的重点内容进行了探讨，包括受试物结构特点、相关动物种属选择、关注免疫相关的毒性反应以及首次人体临床试验起始剂量选择等，以期为申办方和研究者提供参考。版权归原文作者和出版社所有，一并致谢！

双特异性抗体药物非临床研究的考虑要点-

闫莉萍 张旻 王庆利 王海学

国家食品药品监督管理总局药品审评中心

   随着生物技术的快速发展，双特异性抗体已经成为新药研发的热点。最引人注目的作用是通过双靶向T细胞和肿瘤细胞，激发免疫反应将肿瘤细胞杀死。双特异性抗体的结构多样，作用复杂，与一般抗体相比，双特异性抗体的研发具有更大的挑战。双特异性抗体的非临床研究除了参考一般生物制品的指导原则外，更需要考虑如何选择相关动物种属、关注免疫相关的毒性反应如细胞因子释放综合征，同时在非临床研究向临床试验转化中更为谨慎地拟定首次临床试验起始剂量等。本文汇总分析了双特异性抗体药物非临床研究需特别关注的问题。

   双特异性抗体；非临床研究；肿瘤治疗；相关动物种属；细胞因子释放综合征；首次临床试验起始剂量；

   随着生物技术的发展，抗体作为成熟的治疗药物，在肿瘤和免疫疾病治疗领域发挥着重要的作用。为适应临床需求，针对抗体类生物制品进行的改造工作不断发展，相继研发出抗体偶联药物和双特异性抗体。双特异性抗体有多种结构形式，大致可分为含有Fc区的IgG类双特异性抗体和不含Fc区的双特异性抗体2组^[1]。2组药物又可分别细化为多个类别。研究者根据不同的适应证或者作用特点，通过结构改造以期对此类药物的分子大小、效价、半衰期和生物分布进行调整。

   双特异性抗体主要的作用特点是通过双靶向免疫抗原和肿瘤抗原，激发机体免疫反应而杀死肿瘤细胞。目前上市的2个双特异性抗体，分别为2009年欧盟批准上市的catumaxomab (anti-Ep CAM×anti-CD3）和2014年FDA批准上市的blinatumomab (anti-CD19×anti-CD3)，均通过上述机制发挥疗效。Catumaxomab^[2]是一个Triomab结构形式的IgG样双特异性抗体，靶向作用于T细胞和上皮细胞黏附分子(Ep CAM)过表达的肿瘤细胞，通过T细胞活化、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibodydependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)、补体介导的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)来抑制肿瘤细胞，被批准用于标准治疗无效或不可行的Ep CAM阳性肿瘤所致的恶性腹水的治疗。Blinatumomab^[3]为不含Fc区双特异性抗体，采用Bi TE (bispecific T cell engager）结构形式。Blinatumomab抗CD3部分结合T细胞，通过抗CD19部分结合恶性和正常B细胞，从而诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用，被批准用于治疗费城染色体阴性前体B细胞急性淋巴性白血病。

   双特异性抗体除了同时靶向免疫效应抗原和疾病抗原外，还可通过靶向2个疾病相关抗原来产生协同的药效作用。另外一种设计新颖的双特异性抗体是通过靶向2个分子，促使产生功能性复合物^[1]。

   目前，尽管有2个上市药物的研发经验，但由于双特异性抗体结构形式复杂，作用特点多样，使其非临床研究相对一般抗体而言存在新的问题和挑战。本文将着重分析探讨双特异性抗体在非临床研究中需要特别关注的问题。

1.1 结构特征

   随着基因工程的发展，出现了多种双特异性抗体结构形式，目前约有60种不同的双特异性抗体在开发中。

   含有Fc区的双特异性抗体具有IgG样结构，称为双特异性IgG抗体或者双特异性IgG类抗体。此类双特异性抗体的相对分子质量较大(>100000 kD)。抗体的Fc结构域可介导ADCC，CDC等生物学功能。Fc结构域有助于改善产品的溶解性与稳定性，并有利于研究者通过现有通用抗体平台技术实现产品的纯化。大分子质量和FcRn介导的吸收使此类双特异性抗体具有较长的半衰期^[4]。

   不含Fc区的双特异性抗体包含2个抗体的可变重链区和可变轻链区，并可在Fab片段的基础上进行改构。此类双特异性抗体相对分子质量小，可以在原核细胞中表达，容易穿过组织及肿瘤细胞到达靶位点。由于不含抗体Fc区，此类抗体通常缺乏Fc介导的ADCC，CDC效应，且通过肾脏迅速清除，故半衰期较短。例如已上市的blinatumomab在血液中的半衰期只有2.11 h，1个疗程需要通过注射泵连续给药28 d^[3]。另外，引入了非天然连接肽段或额外结构域的抗体，其相对分子质量大小和理化性质均有别于天然Ig G抗体，更容易形成聚集体，由此可能增加免疫原性。目前，此类双特异性性抗体主要有Bi TE，DART (dual affinityre-targeting)，TandAbs，Nanobody等^[5]。

1.2 结构选择的考虑因素

   双特异性抗体开发中，对于分子结构形式的选择非常重要。通常最佳的结构应该能够与作用机制和临床治疗作用相匹配。一般需要构建几个结构形式的抗体，根据临床前体内外试验结果筛选一个最佳的结构形式。一个理想的结构形式应具有以下特点^[1,4]：(1)保留各组分的靶点亲和力和生物活性，同时结合到2个靶抗原。(2)具有理想的成药性，如高热稳定性、高化学稳定性、高溶解性、不易聚合、低黏性、高表达量。(3)限制杂质的数量和/或有利于杂质的去除。

   对于双靶点的亲和力是否差异化，有观点认为^[3]T细胞重定向机制的双特异抗体对免疫靶点和疾病靶点的亲和力需要具有一定的差异。研究显示，blinatumomab结合人CD19的亲和力相对较高(K_D=1.49×10^-9mol·L^-1)，结合人T细胞上的CD3ε的亲和力较低(K_D=2.6×10^-7mol·L^-1)。选择相对较弱的结合CD3ε亲和力的目的是保证只有同时结合靶细胞时才能激活T细胞信号通路。在无靶细胞的情况下，blinatumomab并不会激活T细胞^[3]。而且blinatumomab对T细胞的受体占有较低，其激活T细胞所介导的肿瘤靶细胞的裂解与自然过程中细胞毒T细胞所介导的免疫反应十分类似。

   在某些双特异性抗体中，效应功能作为作用机制的一部分导致靶细胞清除。因此，选择带有F_C区的Ig G结构形式，通过ADCC，CDC效应清除靶细胞。但也有些含有F_C区的双特异性抗体根据作用特点，在获得长半衰期的同时，通过结构改造去除ADCC，CDC功能。附着IgG样双特异性抗体(bispecific by appending IgG）中，附着靶抗原结合部分有时会影响F_C功能，F_C功能可能变强也可能变弱。因此，对于附着IgG样双特异性抗体，需要对附着位点进行研究，以期获得合适的Fc功能^[4]。

   长半衰期是许多双特异性抗体理想的药物特征，通常可通过设计F_C与FcRn受体结合而获得长半衰期。不含F_C区的双特异性抗体通常半衰期较短。有时短半衰期对于某些应用是合适和理想的。也可通过某些技术例如引入血浆白蛋白结合位点来延长半衰期，或者直接将双特异性抗体片段与白蛋白融合来达到延长半衰期的目的^[5]。

   非临床研究的目的在于解释临床试验前至整个临床试验过程中的药理和毒理作用。由于许多生物技术药物具有种属特异性，选择相关动物种属进行药理毒理研究十分重要。生物活性可用体外测定法予以评价，以确定产品的何种作用与临床药效相关。细胞系和/或原代细胞培养常用于检测药物对细胞表型和增殖的直接作用。综合考虑体内、外试验结果有助于将临床前发现外推至人。评价药理作用的体内试验，包括作用机制研究，常用来支持临床研究中适应证的选择。生物技术药物的安全性评价方案一般应包括2种相关种属的动物，但如果只有1种相关种属时，可仅采用1种动物种属进行试验。如果无相关种属时，应考虑使用表达人源受体的相关转基因动物或使用替代分子。对于治疗晚期肿瘤的生物技术药物的非临床研究的类别和时间安排可遵循ICH S9指导原则，用于其他适应证的生物技术药物可参考ICH M3指导原则。基本原则是非临床的研究期限应支持临床试验计划^[6]。

   双特异性抗体结构多样，作用机制复杂，除遵循一般抗体非临床研究的总体规则外，在相关动物种属、免疫毒性、首次临床试验起始剂量拟定以及生物分析方面面临新的挑战。

3.1 相关动物种属

   在抗体的非临床研究评价中，最重要的环节是选择相关种属。所谓相关种属，是指受试物在此类动物上由于受体或抗原决定簇的表达能产生药理活性。免疫化学和功能试验等许多技术可用于确定相关种属。受体/抗原决定簇的分布有时也是相关种属的考虑因素^[6]。双特异性抗体因涉及到2个靶抗原，相关种属选择时考虑的因素更加复杂，无任何相关动物种属的情况更为常见。通常，抗体或者双特异性抗体的研究中如果没有相关动物种属或者只有黑猩猩是相关动物种属时，需考虑采用替代分子或/和转基因动物进行试验。在采用替代分子或/和转基因动物进行试验时应充分验证可行性。

   已上市药物blinatumomab^[3]能够以高亲和力识别人和黑猩猩的CD19和CD3ε分子，并对人和黑猩猩B细胞有功能上的活性。Blinatumomab不结合其他非人灵长类动物(狒狒、食蟹猴、猕猴、非洲绿猴和狨猴）、犬和啮齿动物的B细胞和T细胞。研究者在黑猩猩中进行了有限的毒性评价，为了进一步研发的需要，使用识别小鼠CD19和CD3分子的大鼠抗小鼠单抗mu S103new在小鼠中进行了毒性研究。Blinatumomab的研究者对mu S103new进行了一系列验证研究，包括靶点亲和力试验，体外肿瘤杀伤药效试验、T细胞活化试验以及细胞因子释放试验，结果显示，二者在以上各项指标均有相似的作用特征。

   另一个上市药物catumaxomab的文献资料显示^[2]，catumaxomab没有与人相关的动物种属。研究者采用非相关动物种属食蟹猴、啮齿动物、犬进行的单次给药毒性试验显示，即使在非常高的剂量下都没有急性毒性反应。因此，研究者没有采用非相关动物种属进行重复给药毒性试验。采用能够抗小鼠CD3的替代抗体进行了毒性、药动学试验。但是由于替代抗体的抗Ep CAM部分与人Ep CAM结合，因此研究者在临床起始剂量的拟定上没有采纳替代分子的数据。

      CEA-TCB^[7]为靶向T细胞CD3ε和癌胚抗原CEA的双特异性抗体，现处于临床研究中。种属间基因同源性分析发现，人CEA同源分子在恒河猴(猕猴和食蟹猴）中存在，在犬和啮齿动物中不存在。CEA-TCB与h CEA特异结合，不与食蟹猴CEA结合，与人和食蟹猴的CD3ε结合，与小鼠的CD3ε不结合，因此没有相关动物种属。研究者考虑采用食蟹猴同源抗体以及表达人CEA和人CD3ε的转基因小鼠(h CEA/h CD3εTg）进行非临床研究。对替代分子进行的验证试验显示，猴CEA-TCB在没有靶细胞时可导致T细胞激活，但是CEA-TCB在没有靶细胞时，不会引起食蟹猴和人全血T细胞激活。对于转基因小鼠的验证试验结果显示，转基因小鼠脾细胞介导的肿瘤杀伤药效比人外周血单核细胞介导的药效低40倍，且转基因小鼠的人CEA的表达分布与人有较大差异。基于验证结果，研究者放弃采用替代抗体和转基因小鼠进行非临床研究。

   对于T细胞重定向双特异性抗体的体内药效动物模型，目前较为常用的是经转化人外周血单核细胞的异种移植NOD/SCID小鼠模型。该模型同时使用肿瘤细胞和人外周血单核细胞，以提供能够响应药物的效应细胞和靶细胞。但是，通常药物不与小鼠CD3结合，缺失同源疾病靶抗原，因此此种模型不适合进行毒性反应的观察^[2,3,7]。

   近年来，有关人类疾病动物模型的研究取得一定进展。这些模型不仅可对产品的药理作用、药动学和剂量确定提供进一步认识，也有助于安全性评价^[5]。

3.2 细胞因子释放综合征

      TGN1412在英国Ⅰ期临床试验中出现的灾难性事件震撼了所有从事该类药物研发的科学家。试验组6名健康男性受试者出现了多器官的衰竭，其中2名出现深度昏迷。目前，已经证实细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome, CRS）是罪魁祸首。CRS是指可能超过150多种炎性介质参与的级联放大的系统性免疫应答。尽管CRS的启动机制尚不清楚，但是通常认为它是由某些炎性细胞的活化导致的，尤其是单核细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞。随着IL-6和IL-10的升高，部分病例中IL-2和IL-8也会升高，在最初1~2 h内出现的TNF-α和IFN-γ急剧升高是CRS的主要特点。临床病例报道出现疲倦、头疼、荨麻症、瘙痒、鼻炎、支气管痉挛、呼吸困难等症状^[8]。

   研究显示，T细胞重定向双特异性抗体在杀死靶细胞的过程中，同时也可能诱导新活化的T细胞暂时性地合成并分泌促炎细胞因子。在blinatumomab和catumaxomab^[2,3]的非临床研究中均观察到细胞因子的释放。在黑猩猩每次输液后，blinatumomab能够引起促炎症因子的暂时性释放。临床试验中，受试者也可见细胞因子短暂性释放。Blinatumomab给药后出现频率最高的促炎症因子是TNF-α，IFN-γ，IL-6和IL-2，它们与一系列临床效应相关。这些细胞因子能够导致血压、血管完整性和心脏、肺、肝、肾功能的变化，以及神经系统的症状。在非临床研究中未观察到严重的与细胞因子相关的毒性，但是观察到了与细胞因子效应相一致的生理变化，如两次严重的血压下降，暂时性的心律、体温、肝酶和胆红素上升。

      TGN1412事件以后，研究者和监管机构开始高度重视对CRS进行临床前风险识别和临床风险监控。欧洲医学委员会颁布了最新的人用医学产品的指导原则^[9]，其中针对CRS的条例如下:(1）不能过于依赖临床前体内试验。啮齿类和非人灵长类动物可能都不会表现CRS。(2）完整的安全性评价需要整合所有可用的体内和体外试验数据。(3）应基于所有可用的数据选择合适的开始给药的浓度，以避免最大药理活性的剂量水平。(4）减慢输液速度以便有充足的时间监测不良反应。(5）在第一次临床试验时，应尽量增加单个个体给药的间隔时间，以便有足够的时间发生CRS。研究者开始关注临床前安全性评价的体外试验。经过大量验证，发现外周血单核细胞和全血细胞对于预测CRS具有一定的价值。

   另外，在具有细胞因子释放风险药物的临床前研究中，还应关注细胞因子介导的药物相互作用。研究显示，某些炎症细胞因子可能会通过调控CYP450酶的活性来抑制药物的代谢^[10]。在blinatumomab的非临床研究中，开展了一项细胞因子暂时性升高对CYP450酶活性影响的研究。还有另外一项药物相互作用研究需要给予关注，对于具有细胞因子释放风险的药物在临床使用中通常需要与控制细胞因子释放的激素类药物合用，因此在blinatumomab和catumaxomab的非临床研究中均观察了与激素类药物的相互作用^[2,3]。

3.3 首次临床试验起始剂量的拟定

      TGN1412临床严重不良事件的主要原因是估算临床起始剂量的NOAEL来自一项非相关动物种属毒性试验，该动物种属CD4⁺T细胞不表达CD28。EMA发布的指导原则建议对于高风险药物考虑基于最低预期生物效应剂量(minimum anticipated biologic effect level, MABLE）进行起始剂量的估算。FDA对约30种免疫增强机制的抗体进行了回顾分析，大部分抗体基于MABLE进行了起始剂量的估算^[11]。

      Bi TE等T细胞重定向双特异性抗体通常可引起细胞因子释放，在体内很低浓度下具有活性，剂量反应曲线陡峭。而且多数双特异性抗体在非临床研究中没有相关动物种属进行毒性试验。通常替代抗体的安全性研究结果仅有助于毒性风险的预测和识别，替代抗体在动物的暴露量与治疗抗体在人中的暴露量没有直接相关性。综合考虑，免疫激发机制的双特异性抗体一般应采用MABLE进行起始剂量的拟定。

   在CEA-TCB的开发过程中，没有相关种属进行非临床安全性研究，替代抗体和转基因动物均不适合进行安全性研究，研究者采用MABLE进行了首次临床试验起始剂量的拟定。为选择合适的MABLE，研究者进行了多项体外试验以获得EC₅₀，包括肿瘤细胞杀伤试验、T细胞激活试验、T细胞分化试验以及细胞因子释放试验。经比较，这几项试验中最敏感的试验是肿瘤杀伤试验，此项试验最能反映作用机制与作用效应的关联。选择最敏感的2个肿瘤细胞系的结果来确定肿瘤细胞杀伤的EC₂₀ (20%最大药效浓度）。通过EC₂₀预测人的C_max，基于人3 L的血浆容量，计算获得起始剂量。研究者进一步对获得的起始剂量进行了安全验证，通过解离常数，估算受体占有，对于CD3受体，EC₂₀时的受体占有为0.11%，CEA的受体占有为31%。0.11%低于受体激动剂常用的1%的推荐值。同时，该起始剂量比引起细胞因子释放的剂量低1 000倍之多。采用EC₅₀估算的剂量比EC₂₀高2倍，但均低于按1%受体占有估算获得的起始剂量。尽管目前确定的起始剂量低于从小鼠体内药效结果预测的有效剂量，但是可以确保这个起始剂量是一个相对安全的剂量^[7]。

3.4 生物分析

   双特异性抗体的药动学特征受结构影响较大，含有F_C区的Ig G样双特异性抗体与不含F_C区的双特异性抗体在药代特征上具有较大的差异。前者的药代特征是典型的单抗的药动学特征，后者的药动学特征类似于小分子。

   双特异性抗体，例如DVDs (Dual-variable domains），可以看作是具有双倍抗原结合结构域的抗体，并且2个结合位点对各自的靶点是有活性的，所以需2个专用的药动学(pharmacokinetics, PK）试验来满足分析任务，2个试验的结合结构域都与靶点结合。因此，双特异性抗体需要双倍的生物分析工作量。为了改善这一状况，有研究者采用“嵌合设计”用于PK试验。嵌合设计的原理是使用2个靶点(配体A和B）进行试验设计，2个靶点配体都参与PK试验。与配体A既用于捕获也用于读取结果的方法相比，嵌合法中配体A用于捕获，配体B用于读取结果，或相反^[12]。

   对于肿瘤靶向双特异性抗体，肿瘤部位的分布是关键考察因素，因此应考虑在异体移植模型中进行分布研究，以深入了解药物的药动学/药效学(pharmacokinetics/pharmacodynamics, PK/PD）。

   双特异性抗体在复杂的结构中引入不同的互补决定簇(complementarity-determining regions, CDRs），增加了免疫原性风险。在非临床阶段对免疫原性进行评估可以帮助解释研究结果，并且有助于在临床试验开展之前制定免疫原性研究计划。双特异性抗体的抗药抗体研究中，除了筛选试验和确定试验外，应考虑进行表位特异性试验^[13]。

   双特异性抗体在带来新的疾病治疗方法的同时，也为研发者和监管机构带来新的挑战。双特异性抗体在药物研发的初期，需要进行优化的生物学效应和作用机制研究，将抗体特性 (如双臂的相对亲和力）和预期的作用特点进行匹配。在药物从临床前向临床迈进的过程中，为了选择合适的临床起始剂量、制定可行的临床方案，临床前应对药物进行充分的药理、安全性以及药动学研究，对药物在临床的作用方式、毒性风险、安全范围进行预测和识别。双特异性抗体结构多样，作用机制复杂，非临床研究具有更大的挑战性，除了参考一般生物制品的非临床研究指导原则外，更需要考虑如何选择靶点相关的非临床研究动物种属、关注免疫相关的毒性反应如CRS，同时在非临床研究信息向临床试验转化中更为谨慎地设计首次临床试验剂量等。具有免疫毒性高风险的双特异性抗体，在没有非临床安全性研究的相关动物种属时，可考虑基于体外试验进行风险识别，基于MABLE进行首次临床试验起始剂量的拟定。

参考文献

   详见《中国新药杂志》2017年第26卷第17期

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