文献解读：PRDX1通过抑制体外和体内肺成纤维细胞增殖和上皮间充质转化负调控博来霉素诱导的肺纤维化
PRDX1通过抑制体外和体内肺成纤维细胞增殖和上皮间充质转化负调控博来霉素诱导的肺纤维化
CELLULAR & MOLECULAR BIOLOGY LETTERS | PRDX1 negatively regulates bleomycin-induced pulmonary fbrosis via inhibiting the epithelial-mesenchymal transition and lung fbroblast proliferation in vitro and in vivo
近日，《CELLULAR & MOLECULAR BIOLOGY LETTERS》杂志（IF 8.3\Q1区）刊登了一篇题为“PRDX1 negatively regulates bleomycin-induced pulmonary fbrosis via inhibiting the epithelial-mesenchymal transition and lung fbroblast proliferation in vitro and in vivo”《PRDX1通过抑制体外和体内肺成纤维细胞增殖和上皮间充质转化负调控博来霉素诱导的肺纤维化》的研究性论文，该文章通过不同的细胞和动物模型，采用MTT法、纤维化形态学观察、划痕实验、荧光显微镜、流式细胞术、ELISA、western blot、转录组测序、组织病理学分析等实验方法，得出PRDX1是博来霉素（bleomycin，BLM）诱导肺纤维化进展的关键分子，并通过调节上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT)和肺纤维化细胞增殖起作用的结论，认为PRDX1可能是治疗BLM诱导的肺纤维化的治疗靶点，医科院药物所安评中心研究生旷煉同学对文章进行了解读分享。文章分享内容如下：
研究背景
过氧化物酶体脱氧素（peroxiredoxin，PRDX）过氧化物酶家族，相对分子量为22-27 kDa，共六个成员：PRDX1-6。PRDX1作为活性氧（ROS）的清除剂，可以抑制氧化应激诱导的细胞损伤，与蛋白质相互作用，在调节细胞增殖、分化、凋亡、衰老、癌症和其他疾病方面表现出多种功能。研究表明，细胞氧化还原状态的变化与许多肺部疾病有关，肺纤维化患者肺组织中PRDX1的表达升高。
磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路是调节细胞活动的中心信号通路之一。PI3Ks是一组与质膜相关的脂质激酶，可在人肺成纤维细胞中表达。BLM诱导的肺纤维化依赖于ROS的产生，ROS可以通过PI3K/AKT信号通路参与肺损伤。JNK1已被证明具有抗纤维化作用。TGF-β1和TGF-β3可以通过磷酸化依赖性机制直接刺激JNK的激活。JNK还参与Smad2、3的磷酸化，并对TGF-β诱导的转录激活至关重要。然而，目前尚不清楚PRDX1是否通过JNK/Smad途径调节成纤维细胞的增殖能力，从而影响肺纤维化的发展。
实验设计
本次实验分别用质粒转染肺上皮细胞系BEAS-2B和分离原代小鼠胚胎成纤维细胞进行细胞实验，验证了PRDX1敲除与肺上皮细胞EMT和ROS的关系以及PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路在PRDX1相关的肺纤维化调节中的作用。后又用基因敲除小鼠进行动物实验，证实了PRDX1在肺纤维化中的调节作用和PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路在小鼠肺纤维化过程中的作用。具体实验步骤及方法如图：
实验结果
1、PRDX1敲除促进肺上皮细胞EMT和ROS水平增加
- MTT结果表明细胞活力随着BLM浓度的增加而显著降低，shPRDX1细胞的活力高于对照细胞。
- 定量流式细胞术分析显示，用10μg/mL BLM处理后，转染细胞内ROS水平显著高于对照细胞。
- 免疫荧光图像显示，与对照细胞相比，shPRDX1细胞内和线粒体中的ROS水平增加；线粒体膜电位降低。
- 细胞形态上观察到，在10μg/mL BLM处理72小时后，可见明显纤维化变化。
- 划痕实验显示，转染细胞的迁移能力显著高于对照细胞。
结果表明，敲除PRDX1促进线粒体损伤、诱导上皮细胞的形态学变化、增强细胞迁移能力。
2、PRDX1敲除通过PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路促进上皮EMT过程
- PRDX1敲除显著升高EMT相关蛋白和纤维化相关蛋白的表达水平。
- PRDX1敲除可促进TGF-β1分泌。
- BLM处理48小时和72小时后，PI3K/Akt和JNK/Smad蛋白磷酸化水平显著升高。用PI3K抑制剂（SP600125）和JNK抑制剂（LY294002）预处理后，可恢复PI3K活性。
3、PRDX1基因敲除显著增加原代肺成纤维细胞中TGF-β的分泌、ROS的产生和细胞迁移
用BLM（0，5，10，20，30，40μg/mL）处理原代小鼠肺成纤维细胞72小时后：
- MTT结果显示，10μg/mL BLM诱导后，PRDX1-KO细胞的生存能力显著高于WT细胞。
- PRDX1-KO细胞中TGF-β1的分泌显著高于WT细胞。
- PRDX1-KO细胞中的细胞内和线粒体ROS水平显著升高。
- PRDX1-KO细胞的迁移能力显著高于WT细胞。
抑制PRDX1可以提高细胞活力和诱导TGF-β1分泌，BLM处理可以显著增强原代肺成纤维细胞的迁移能力，进一步显示成纤维细胞增殖和分化能力的改变。线粒体损伤没有明显差异，可能是因为肺成纤维细胞在BLM诱导后期对ROS不敏感。
4、PRDX1敲除通过PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路细胞增殖、细胞周期循环和纤维化进展
用10μg/mL的BLM处理0、24、48和72小时后：
- MTT结果表明，PRDX1-KO细胞活力明显下降；PRDX1-KO细胞活力高于WT细胞活力。
- 流式细胞术显示：与WT细胞相比，G0/G1期的PRDX1-KO细胞数量增加，S期和G2/M期的细胞数量减少。此外，PRDX1-KO细胞的增殖能力显著增强。蛋白质印迹分析显示，PRDX1缺乏显著促进细胞周期相关蛋白和纤维化相关蛋白表达。
用10μg/mL BLM处理后，对WT和PRDX1KO FMLF细胞进行转录组测序，以分析差异基因表达。
- 在PRDX1-KO细胞中，细胞周期蛋白P21和P16显著下调，胶原相关基因显著上调，PI3K、JNK和Smad上调（图4E–G）。
- 蛋白质印迹分析显示，PRDX1敲除促进PI3K、JNK和Smad的磷酸化。
这些结果表明，PRDX1缺乏通过强烈激活JNK/Smad途径促进S和G2/M细胞周期，从而加速肺成纤维细胞的增殖，促进其向肌成纤维细胞的转化，增加胶原的表达，最终促进肺纤维化。
5、PI3K/Akt和JNK/Smad信号传导是BLM诱导的PRDX1-KO细胞肺纤维化的关键途径
为了证实PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路在PRDX1相关的肺纤维化调节作用，用PI3K（LY294002）和JNK（SP600125）抑制剂预处理FMLF细胞（以下分别为LY和SP）。
- 蛋白质印迹分析显示，在用SP和LY预处理的FMLF细胞中，显著抑制BLM诱导的信号通路激活，并且改变与EMT和纤维化相关的蛋白表达水平。SP对细胞周期具有显著的抑制作用，而LY对纤维化相关蛋白具有显著的抑制剂作用。
6、BLM诱导PRDX1-KO小鼠更严重的肺纤维化
- 在BLM诱导后的第二周，两只PRDX1-KO小鼠死亡、体温和体重未显示显著波动。
- PRDX1-KO小鼠血清中TGF-β1水平升高。
- HE染色结果显示，PRDX1-KO小鼠肺组织出现严重的肺纤维化；。
- EMT相关蛋白在肺组织中发生改变；细胞周期蛋白P21和P16下调，而纤维化蛋白、α-SMA和胶原上调。
这些结果表明，PRDX1可以通过调节EMT和细胞周期蛋白以及胶原蛋白的表达促进小鼠肺纤维化。
7、PRDX1通过PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路促进BLM诱导的小鼠肺纤维化
通过分析评估了肺组织中的磷酸化。
- 蛋白质印迹结果显示：PRDX1-KO小鼠肺组织中PI3K、Akt、JNK和Smad磷酸化水平显著升高。Akt和PI3K磷酸化水平的升高更为明显；这可能是由于肺组织中的复杂环境，导致小鼠体内和体外表型之间的差异。
结果表明，PRDX1主要通过PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路调节BLM诱导的小鼠肺纤维化
总结讨论
该文章中涉及到的Western Blot相关的蛋白如下：
与纤维化相关蛋白：Collagen Ⅰ、 Collagen Ⅲ、α-SMA、Fibronectin
EMT相关蛋白：N-Cadherin、E-Cadherin、Vinertin、SIuge
细胞周期相关蛋白：Cyclin B、P16、P21、PCNA
PI3K/Akt信号通路：PI3K、P-PI3K、 Akt、P- Akt
JNK/Smad信号通路： JNK、P- JNK 、 Smad2、P- Smad2 、 Smad3 、 P-Smad3
讨论分析
研究的结果并没有证明PRDX1是如何激活PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路的。生物信息学网站，如TargetScan、miRDB和miRTarBase，可以与本文提供的转录组测序结果一起用于分析PRDX1与PI3K/Akt和JNK/Smad信号通路之间的潜在靶mRNA功能。
原文文献
DOI: 10.1186/s11658-023-00460-x
文献整理：旷煉
核对审核：付小桐 靳洪涛